創(chuàng)新藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)Innovative drug target discovery
技術(shù)平臺(tái)
熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析(thermal proteome profiling, TPP) 是細(xì)胞熱漂移測(cè)定(cellular thermal shift assay, CETSA) 與定量質(zhì)譜(quantitative mass spectrometry, MS)的結(jié)合，所以也稱為MS-CETSA。熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析通過(guò)測(cè)量不同加熱溫度下細(xì)胞或細(xì)胞裂解物中可溶蛋白的含量來(lái)確定整個(gè)蛋白質(zhì)組的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)可以在與藥物或代謝物等小分子、核酸或其他蛋白質(zhì)相互作用或在翻譯后修飾時(shí)改變其熱穩(wěn)定性，而熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以根據(jù)有無(wú)配體結(jié)合蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性差異來(lái)確定靶蛋白。目前熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析已成功應(yīng)用于識(shí)別藥物的靶點(diǎn)和脫靶點(diǎn)，當(dāng)藥物或配體與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，它可以改變 Tm（熱變性中點(diǎn)溫度），從而能夠檢測(cè)藥物與靶標(biāo)的相互作用。這種方法廣泛用于藥物發(fā)現(xiàn)和蛋白質(zhì)組學(xué)，以研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、相互作用和翻譯后修飾。
技術(shù)流程
經(jīng)藥物小分子處理的樣品，在不同溫度條件下加熱，高速離心收集上清，后續(xù)可進(jìn)行凝膠成像、免疫印跡成像或質(zhì)譜分析，擬合蛋白熱融解曲線，計(jì)算蛋白的熱變性中點(diǎn)溫度(melting temperature, Tm)。從全蛋白質(zhì)組識(shí)別藥物的靶點(diǎn)和脫靶點(diǎn)蛋白。
用不同濃度小分子處理細(xì)胞裂解液，并在相同的溫度下加熱，高速離心收集上清，后續(xù)可進(jìn)行凝膠成像、免疫印跡成像或質(zhì)譜分析，最后通過(guò)數(shù)據(jù)處理可以獲得每種蛋白質(zhì)的劑量反應(yīng)曲線。TPP-CCR側(cè)重于反應(yīng)小分子濃度的重要性，可通過(guò)測(cè)定EC50對(duì)不同蛋白質(zhì)靶標(biāo)的結(jié)合親和力進(jìn)行排序。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
01.無(wú)需改造目標(biāo)小分子，避免構(gòu)效關(guān)系變化，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
02.適用于純蛋白，裂解液（細(xì)胞或組織等），活細(xì)胞
03.數(shù)據(jù)可反映蛋白-小分子直接相互作用
應(yīng)用范圍
靶蛋白和脫靶蛋白的系統(tǒng)鑒定
藥物分子對(duì)靶蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力分析
內(nèi)源代謝物的相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)分析
應(yīng)用案例
項(xiàng)目需求：以熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞裂解液中，驗(yàn)證目標(biāo)小分子與靶蛋白是否直接結(jié)合。
解決方案：分別利用免疫印跡（圖1）和溫度梯度的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析TPP-TR（圖2）、小分子濃度梯度的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析TPP-CCR（圖3），對(duì)目標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析。
數(shù)據(jù)展示：
